El contraste de interferencia diferencial (DIC). El contraste de interferencia diferencial (DIC) es una técnica de iluminación que permite visualizar estructuras transparentes explotando los cambios del índice de refracción. Esta técnica no tiene elementos que obstruyan el camino óptico de la luz, lo que permite aprovechar las aperturas completas del condensador y objetivo obteniendo imágenes de mayor resolución. A diferencia del contraste de fase, el DIC convierte los gradientes de la longitud del camino óptico de la muestra en diferencias de amplitud que se pueden visualizar como contraste mejorado en la imagen resultante. El DIC polariza la luz emitida por un microscopio, divide la luz en dos haces separados utilizando un prisma especializado, y luego recombina la luz devuelta causando interferencia, lo que lleva a aclaramientos y oscurecimientos en la imagen. Esta técnica permite observar con gran detalle incluso objetos transparentes o con poco contraste.
En la configuración básica del microscopio con DIC, la luz emitida desde la fuente de iluminación pasa a través de un polarizador lineal, ubicado entre el puerto de luz y el condensador, el cual filtra selectivamente el plano de vibración de la luz. Posteriormente, la luz polarizada incide sobre un prisma especializado, ubicado en el plano focal frontal del condensador, que consta de dos cuñas cementadas por la hipotenusa, hechas de un material birrefringente, cuyos ejes ópticos se encuentran perpendicularmente orientados entre sí. Este prisma divide el rayo polarizado incidente en dos rayos individuales, denominados el rayo ordinario y extraordinario. Después de salir del prisma, los frentes de onda ordinarios y extraordinarios, separados por una pequeña distancia de aproximadamente 0.2 µm, viajan paralelamente hacia la muestra. Al llegar a esta, los rayos pasan por puntos adyacentes y sus caminos ópticos se alteran ligeramente, de acuerdo a los diferentes espesores, pendientes e índices de refracción con los que se encuentren, generando un desfase relativo entre sí. Subsiguientemente, son colectados por el objetivo y se enfocan sobre su plano focal posterior, donde son recombinados por un segundo prisma, cuya orientación está invertida con respecto al prisma del condensador. Esta recombinación genera una onda resultante con trayectoria elíptica que viaja hacia un segundo polarizador, conocido como analizador, el cual tiene un eje de transmisión perpendicularmente al del polarizador. La porción de la onda resultante que vibra paralela al eje de transmisión del analizador logra atravesarlo y se proyectará hacia los oculares.
La introducción de retardo es un mecanismo adicional que se utiliza en la microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) para alterar el contraste y/o el color de la muestra. En la configuración básica del microscopio con DIC, el prisma del objetivo introduce un cambio de fase que se compensa exactamente con el que se produce por el prisma del condensador. Sin embargo, al mover el prisma del objetivo horizontalmente hacia uno de sus extremos, las trayectorias no van a ser compensadas exactamente, sino que van a experimentar una diferencia de trayectorias, antes de intercambiar identidades. Esto hace que una de las ondas ya sea la ordinaria o la extraordinaria (dependiendo si entran por el lado derecho o izquierdo del prisma) salga antes que la otra. A medida que el prisma se desplaza, los pares de frentes de onda se retrasan cada vez más y se desfasan entre sí. Por lo tanto, la orientación del vector de polarización de la luz emergente del prisma del objetivo, puede ajustarse de lineal (sin traslación) a diferentes grados de elíptica, e incluso circular.
En la técnica de DIC, las imágenes presentan una apariencia de sombreado, donde un lado de la muestra se percibirá brillante (o posiblemente en color), mientras que el otro lado aparecerá más oscuro (o de otro color). Los sombreados evocan una iluminación oblicua, cuya dirección aparente, va a estar dada por la orientación del prisma. Este efecto genera un aspecto pseudo tridimensional, que debe interpretarse con el entendimiento de que las sombras indican el signo y la orientación de la pendiente de los gradientes de fase o trayectoria óptica, y no necesariamente revelan parámetros geométricos o topográficos precisos.
Contraste de fases Vs. Contraste de interferencia diferencial. La microscopía de contraste de fase y contraste de interferencia diferencial (DIC) son técnicas complementarias capaces de producir imágenes de alto contraste.
Fundamentos ópticos para la formación de contraste. En la microscopía de contraste de fase, el contraste se produce en función de la magnitud de la longitud del camino óptico de la muestra; Las zonas u organelos densos, las cuales tienen grandes longitudes de camino, aparecen más oscuras que el fondo, mientras que las áreas delgadas, con índices de refracción menor que el medio circundante, se percibirán mucho más claras que fondo gris. En el contraste de interferencia diferencial, los gradientes de la longitud del camino óptico se convierten en diferencias de amplitud, que se pueden visualizar como contraste mejorado la imagen resultante.
Resolución. Una de las principales ventajas del DIC sobre el contraste de fase, es la capacidad de utilizar el instrumento con una apertura numérica completa, sin los efectos de enmascaramiento de las placas de fase o los anillos del condensador, que obstruyen el trayecto óptico de la luz. El principal beneficio es una mejor resolución axial.
Efecto de orientación. En el DIC, debido a la orientación asimétrica de los prismas divisores, con respecto al eje óptico del microscopio y a los polarizadores, el contraste en la imagen es dependiente de la orientación y/o rotación de la muestra; especialmente en muestras de fase lineales. Por el contrario, el contraste de fases, carece del efecto de orientación, debido a que la placa de fase anular ubicada en el condensador es rotacionalmente simétrica en 360 grados e ilumina la muestra uniformemente desde todos los ángulos.
Apariencia. Como se mencionó anteriormente, el contraste de fases presenta el efecto de halo y Shade-off característico de esta técnica. La intensidad de este efecto va a depender tanto del tamaño de la muestra, como de las diferencias entre los índices de refracción de la muestra y el medio circundante. Por el contrario, en la técnica de DIC, la calidad de la imagen no se ve afectada por las grandes diferencias de índice de refracción y ni por el tamaño de la muestra. De hecho, las diferencias pronunciadas de índice de refracción entre la muestra y el medio circundante generan imágenes de alto contraste. Por otro lado, contrario las imágenes de contraste de fases, las imágenes de DIC presentan una apariencia tridimensional con simulación de iluminación oblicua, lo que genera imágenes con sombreado de alto contraste.
Muestras birrefringentes. Una de las grandes ventajas que tiene el contraste de fase sobre el DIC, es su capacidad de obtener buenas imágenes con muestras birrefringentes, ya que esta no requiere del uso de luz polarizada y está libre de perturbaciones ópticas generadas por este tipo de muestras. Por el contrario, para la microscopia de DIC, las muestras birrefringentes representan un problema, ya que los colores de interferencia y artefactos de birrefringencia enmascaran las estructuras y los detalles internos de las muestras generando imágenes confusas, con poco contraste y de poca calidad.
Como se revisó anteriormente, cada una de estas técnicas, tiene ventajas y desventajas que facilitan la visualización de detalles y características específicas en diferentes tipos de muestras. Por lo tanto, deben considerarse y utilizarse como técnicas complementarias para investigar plenamente las propiedades ópticas, la dinámica y la morfología de las muestras.
