La técnica de iluminación de Köhler es una de las más importantes y fundamentales en cualquier configuración de microscopio óptico. Esta técnica permite lograr una iluminación homogénea en todo el campo de visión, maximizando el contraste de la imagen, minimizando la luz parásita y facilitando la obtención de imágenes con alta resolución y óptimo contraste.
Para lograr esto, en el plano de iluminación se genera una imagen del filamento de la lámpara enfocada en el plano focal del diafragma de apertura del condensador, en el plano focal posterior del objetivo y el punto del ojo, para que los rayos salgan de forma paralela y proporcionen una iluminación homogénea, tanto en la muestra como en las imágenes de la misma. Mientras que, en el plano de imagen, se coloca el objeto entre 1 y dos veces la distancia focal del objetivo, para que se forme una imagen intermedia aumentada exactamente en el punto focal frontal del ocular. De esta manera, el ocular puede recoger esta imagen y producir un segundo aumento, el cual se proyecta en la retina del ojo o en el sensor electrónico.
Para ajustar la iluminación de Köhler en un microscopio invertido, se deben seguir los siguientes pasos:
1. Colocar un objetivo de bajo aumento, como por ejemplo 10X.
2. Abrir completamente el diafragma de campo, de apertura y ajustar el brillo usando el control de intensidad de iluminación.
3. Enfocar la muestra por medio del tornillo macro-micrométrico con el fin de garantizar la posición adecuada de las aberturas en la trayectoria óptica.
4. Cerrar el diafragma de campo. (Se observará un pequeño círculo de luz en el campo de visión).
5. Si los bordes del círculo se observan borrosos, se debe ajustar la altura del condensador por medio de las ruedas de ajuste, hasta que se logre un enfoque nítido en los bordes del círculo. En el caso que los bordes del círculo estén en un enfoque nítido se prosigue con el siguiente paso.
6. Centrar el círculo en el campo de visión por medio de los tornillos de centrado, los cuales se encuentran normalmente en la parte frontal del condensador.
7. Abrir el diafragma de campo hasta que sus bordes estén justo afuera del campo de visión.
8. Ajustar el diafragma de apertura de acuerdo a los requerimientos específicos. Este ajuste se realiza, ya sea por medio de las guías que traen los condensadores, los cuales indican la apertura indicada para el aumento deseado, o mirando a través de los oculares y haciendo el ajuste de acuerdo a la imagen observada. Cerrar el diafragma de apertura aumenta el contraste y la profundidad de campo, pero disminuye la resolución y lo contrario sucede al abrir el diafragma. Se debe encontrar un equilibrio entre ambos con el fin de obtener una buena resolución y un contraste óptimo.