Aberraciones ópticas: Al utilizar sistemas ópticos reales, es común que se produzcan ciertos comportamientos o desviaciones respecto a los modelos ideales, lo cual se conoce como aberraciones ópticas. En la microscopía, los lentes de los microscopios ópticos de luz sufren de tres principales aberraciones ópticas, las cuales se describen a continuación:
- Aberración esférica: ocurre cuando las ondas de luz que atraviesan un lente con superficie esférica no se enfocan o no convergen en un mismo punto focal. Esto se ve reflejado en la imagen como bordes borrosos y poco nítidos.
- Aberración cromática: ocurre cuando cada longitud de onda se refracta con un ángulo diferente al atravesar el lente y no logran converger en un punto focal común. Esto se ve reflejado en la imagen como bordes borrosos de diferentes colores. Esta aberración se presenta en dos tipos; aberración cromática longitudinal, donde las diferentes longitudes de onda no convergen en el mismo plano focal y la aberración cromática lateral, donde las diferentes longitudes de onda sí coinciden en el mismo plano focal, pero en diferentes posiciones. A diferencia de las aberraciones longitudinales, éstas suelen aparecer más en las esquinas y no en el centro de la imagen. Por el contrario, en la aberración cromática longitudinal, este efecto se ve en toda la imagen.
- Curvatura de campo: ocurre cuando los rayos provenientes de puntos alejados del eje óptico del lente convergen antes de llegar al plano focal. Esto quiere decir que, si se tiene un objeto plano y amplio, los rayos provenientes de las regiones centrales logran converger en el plano focal, mientras que los que provienen de los extremos distantes del objeto convergen antes de llegar al plano focal. Esto hace que un objeto plano y amplio proyecte una imagen curva.
Es importante destacar que estas aberraciones ópticas afectan negativamente la calidad de las imágenes y deben ser corregidas para obtener imágenes claras y nítidas. Además, las lentes convergentes son esenciales en la microscopía, ya que permiten la formación de imágenes ampliadas y nítidas.
Objetivos
Como se mencionó anteriormente, los objetivos son uno de los elementos más importantes en un microscopio, ya que juegan un papel indispensable en determinar la resolución y el aumento que se puede lograr. Actualmente, existe una amplia gama de diseños de objetivos, que cuentan con excelentes características ópticas y proporcionan varios grados de corrección para las diferentes aberraciones ópticas. Éstos se pueden dividir en tres categorías principales; acromático, fluorita y apocromático, los cuales se describen a continuación.
Los objetivos acromáticos son los más económicos y sencillos, comúnmente empleados para labores rutinarias y simples. Estos presentan corrección para la aberración cromática axial en dos longitudes de onda (azul y rojo) y corrección para la aberración esférica en color verde.
La siguiente categoría de objetivos, con un nivel más alto de complejidad, corrección y costo, se conocen como fluoritas o semi-apocromáticos. Similar a los acromáticos, estos objetivos se corrigen para la aberración cromática en dos longitudes de onda (azul y rojo), pero adicionalmente, debido a las avanzadas formulaciones de vidrio que se utilizan para su fabricación, permiten correcciones esféricas adicionales (dos o tres colores). Debido a esto, los objetivos fluoritas normalmente presentan una mayor apertura numérica, produciendo imágenes más brillantes y con mejor resolución.
A un nivel más alto de costo, complejidad, diseño y especificaciones, están los objetivos apocromáticos. Estos presentan corrección cromática para tres colores (rojo, verde y azul), eliminando sustancialmente la aberración cromática e igualmente presentan corrección esférica para dos o tres colores. Debido a su alto nivel de corrección, estos suelen tener aperturas numéricas aún mayores que los objetivos fluorita.
Los objetivos acromáticos, fluorita y apocromáticos, sufren de aberración de curvatura de campo, que como vimos anteriormente, es la proyección de imágenes curvas de objetos planos amplios. Por tal razón, se han producido objetivos adicionales para cada categoría con corrección adicional para dicha aberración. Estos se conocen como plan-acromáticos, plan-fluoritas o plan-apocromáticos. Tal corrección, aunque costosa es bastante valiosa, especialmente para la imagen digital y fotomicrografía convencional.
Sistemas ópticos con corrección al infinito
En un sistema óptico finito, la luz proveniente de la muestra es colectada por el objetivo y posteriormente converge para formar una imagen intermedia. Esta configuración limita la introducción de cualquier tipo de elementos ópticos adicionales. Por el contrario, en los sistemas ópticos con corrección al infinito, el haz de luz transmitido desde una muestra pasa a través del lente del objetivo y se proyecta como un rayo de luz paralelo hacia el lente del tubo, para luego sí formar la imagen intermedia. Esto permite la introducción de componentes ópticos adicionales en el trayecto de la luz como, por ejemplo, prismas, polarizadores, filtros para fluorescencia, entre otros, sin la introducción de aberración esférica o la modificación de la distancia de trabajo del objetivo. Normalmente, esta corrección se representa en la carcasa de los objetivos como el símbolo de infinito.
Es importante destacar que los sistemas ópticos con corrección al infinito son significativos porque corrigen la aparición de imágenes fantasma que con frecuencia se observa en microscopios. Además, las aberraciones ópticas son un problema común en los sistemas ópticos reales y afectan negativamente la calidad de las imágenes. Por lo tanto, la corrección al infinito es una técnica importante en la microscopía para obtener imágenes claras y nítidas.
Nomenclatura. Los parámetros más importantes de los objetivos, suelen estar inscritos en la parte exterior de la carcasa; esto con el fin de facilitar la identificación de sus características, especificaciones y las condiciones necesarias para un uso correcto. Entre ellas tenemos;
- Nombre del fabricante
- Corrección de curvatura de campo. Las abreviaturas más comunes son Plan, Pl, EF, Achroplan, Plan Apo o Plano.
- Aumento. Capacidad de aumento del objetivo, ya sea con números o con una línea de color codificada.
- Propiedades ópticas especializadas. Esto indica las características y los diferentes parámetros de diseño, que optimizan el rendimiento para determinadas condiciones o técnicas específicas, como por ejemplo contraste de fase (PH, Ph), contraste de interferencia diferencial (DIC) entre otros.
- Longitud del tubo. Este valor indica la distancia en milímetros, que debe existir entre el porta objetivos hasta el ocular, para que se forme correctamente la imagen. Inicialmente, los microscopios tenían una longitud de tubo finita, que variaba entre 116 cm- 210 cm aproximadamente. Actualmente, la mayoría de microscopios, están diseñados para trabajar con objetivos corregidos al infinito, los cuales proyectan la imagen al infinito y permiten la introducción de elementos ópticos
- Espesor del cubreobjetos. Este valor indica el espesor del cubreobjetos en milímetros que debe utilizarse para minimizar las aberraciones ópticas. Este espesor está estandarizado (0.17 mm) para la mayoría de las aplicaciones. Igualmente, existen objetivos avanzados que poseen un collar corrección el cual permite usar cubreobjetos de diferentes espesores. Este collar ajusta la posición interna de un grupo central de lentes dentro del objetivo, facilitando así la corrección de las aberraciones, de acuerdo al espesor del cubreobjetos utilizado. Normalmente, se presentan como Corr, w/Corr y CR. Otra consideración importante es el grosor del portaobjetos del microscopio, que es tan crucial para el condensador como lo es el grosor del cubreobjetos para el objetivo. La mayoría de los productores comerciales ofrecen portaobjetos que varían en grosor entre 0,95 y 1,20 mm, siendo el más común muy cercano a 1,0 mm. Un portaobjetos de microscopio de 1,20 mm de espesor es demasiado grueso para usarse con la mayoría de los condensadores de apertura numérica alta que tienden a tener una distancia de trabajo muy corta. Si bien esto no tiene mucha importancia para la observación rutinaria de especímenes, los resultados pueden ser devastadores con fotomicrografía de precisión. Recomendamos que se elijan portaobjetos de microscopio que tengan un grosor de 1,0 ± 0,05 mm y que se limpien a fondo antes de su uso.
- Working distance (WD)/Distancia de trabajo. Distancia que hay entre la lente frontal del objetivo y la parte superior del cubreobjetos, cuando la muestra está enfocada. Las abreviaturas comunes son: L, LL, LD y LWD (distancia de trabajo larga), ELWD (distancia de trabajo extralarga), SLWD (distancia de trabajo super larga) y ULWD (distancia de trabajo ultra larga).
- Apertura numérica. Medida de captación de luz, que determina el poder de resolución y la profundidad de campo del objetivo. En palabras sencillas, es el tamaño del cono de luz captado por el lente frontal del objetivo.
- Medio de inmersión. Medio entre el lente frontal del objetivo y el cubreobjetos. Existen objetivos secos que utilizan el aire como medio entre el objetivo y el cubreobjetos y existen objetivos de inmersión que utilizan medios líquidos, como por ejemplo agua, aceite, glicerina, entre otros. Las abreviaturas comunes son: Oil, Oel (inmersión en aceite), HI (inmersión homogénea), W, Water, Wasser (inmersión en agua) y Gly (inmersión en glicerol).
- Tipo de objetivo según el nivel de corrección esférica y cromática. Acromáticos (Achro, Achromat), fluorita (Fl, Fluar, Fluor, Neofluar o Fluotar) y apocromático (Apo) (apocromáticas).
- País de fabricación.
Cabe aclarar que no siempre toda esta nomenclatura va a estar grabada en la carcasa del objetivo. En algunos casos, solo se presentan los aspectos más importantes, como el aumento, medio de inmersión, apertura numérica y un código o número de artículo, por medio del cual se facilita buscar las especificaciones adicionales en internet o en un catálogo.
Parafocalidad y paracentricidad. Un microscopio es parafocal, cuando sus objetivos tienen una distancia idéntica (la distancia parafocal) desde el agujero de montaje del portaobjetivos (revolver), al punto de foco en el espécimen. Esto permite mantener el mismo punto focal entre objetivos, esto quiere decir que cuando se realiza un cambio de objetivos de diferentes aumentos, la muestra va a permanecer enfocada. Por otro lado, un microscopio parcentrado, es aquel en el que el centro de la imagen permanecerá centrado aun cuando se cambie el objetivo. Esto quiere decir que, si se tiene una región de interés en el centro del campo de visión, al cambiar de objetivo esta región permanecerá en el centro del campo de visión. Estas dos propiedades, aunque comúnmente desconocidas, son importantes, ya que evitan el cansancio visual y el desgaste del equipo.
Consideraciones generales
- Siempre se recomienda empezar una observación con un objetivo de bajo aumento. Esto facilita encontrar la región de interés y el plano focal más rápido y adicionalmente, previene accidentes, como chocar un objetivo de gran aumento con la muestra.
- Siempre realizar el cambio de objetivos por medio del revólver y nunca por medio de su torso, ya que esto puede llegar a desalinear la óptica.
- Precaución al trabajar con objetivos de inmersión: siempre se debe limpiar cualquier superficie que haya tocado el líquido de inmersión (cubreobjetos, portaobjetos, objetivo, etc), antes de cambiar de objetivo o al terminar una observación. Esto con el fin de evitar contaminar o untar objetivos secos o que requieren otro tipo de inmersión.
- Si se presentan impurezas como, partículas, fibras o sustancias no deseadas, éstas se pueden limpiar ya sea con aire comprimido o con etanol al 70% y con papel de arroz.
- Al finalizar una observación, se recomienda dejar siempre el objetivo de bajo aumento y alejar la platina, con el fin de evitar accidentes (chocar objetivos de alto aumento con la platina o la muestra).